圖1. 細(xì)菌單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)面臨的挑戰(zhàn)^[1]

以上原因使得微生物的單細(xì)胞RNA測序技術(shù)及相關(guān)應(yīng)用都進(jìn)展緩慢，同時(shí)也限制了其商業(yè)化的進(jìn)程。

但是這些挑戰(zhàn)真的無法克服嗎？是否有實(shí)現(xiàn)微生物單細(xì)胞RNA測序的方法呢？答案當(dāng)然是有的！近年來，科學(xué)家們不斷技術(shù)攻關(guān)，開發(fā)出了多種細(xì)菌單細(xì)胞RNA測序技術(shù)，如microSPLIT、BacDrop等，并發(fā)表在Science、Cell等頂尖期刊上。

1、microSPLIT技術(shù)^[2]

microSPLIT由華盛頓大學(xué)Georg Seelig教授團(tuán)隊(duì)發(fā)明，于2020年12月17日發(fā)表在Science期刊上。它是一種針對細(xì)菌的高通量scRNA-seq方法，該技術(shù)基于真核細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測序技術(shù)SPLiT-seq^[3]發(fā)展而來，能夠可靠地分析革蘭氏陰性模式菌和革蘭氏陽性模式菌的混合物，可以在單細(xì)胞水平上揭示轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。

圖2. microSPLIT技術(shù)

2、BacDrop技術(shù)^[4]

BacDrop由美國麻省理工學(xué)院哈佛博德研究所的Deborah T. Hung教授團(tuán)隊(duì)發(fā)明，于2023年1月27日在Cell期刊上。它是一種基于液滴的全基因組并行的大規(guī)模細(xì)菌scRNA-seq測序技術(shù)，通過使用多編碼策略克服基于液滴的單細(xì)胞方法中每個(gè)微流體通道可加載細(xì)胞數(shù)量受限的問題，實(shí)現(xiàn)了比基于孔板方法更高的檢測通量。

圖3. BacDrop技術(shù)

從技術(shù)上看，microSPLIT和BacDrop兩種技術(shù)都能夠在較低雙物種污染率的情況下將兩種不同細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄本信息很好地區(qū)分開，證明了單細(xì)菌RNA-seq可以跨越革蘭氏陽性和革蘭氏陰性物種。

從底層技術(shù)講，孔板法需要較為繁瑣的人力操作，穩(wěn)定性較低且通量有限。而液滴微流控技術(shù)可以避免大量人力成本的投入，而且能夠大幅提高細(xì)胞通量，一次可檢測多個(gè)樣本，是單細(xì)胞測序技術(shù)領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。

2022年6月，墨卓生物CTO鄭文山博士在Science期刊上發(fā)表“High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome”^[5]技術(shù)性長文。該技術(shù)利用液滴微流控技術(shù)，首次實(shí)現(xiàn)了高通量單細(xì)胞基因組學(xué)測序，推動(dòng)微生物單細(xì)胞測序進(jìn)入新階段。

在此基礎(chǔ)上，墨卓在微生物單細(xì)胞組學(xué)領(lǐng)域繼續(xù)發(fā)力，突破各種技術(shù)難點(diǎn)，成功在MobiNova?-100高通量單細(xì)胞測序建庫系統(tǒng)上，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌的高通量單細(xì)胞RNA測序，將細(xì)菌單細(xì)胞RNA測序的商業(yè)化進(jìn)程又向前推進(jìn)了一步。

墨卓細(xì)菌單細(xì)胞RNA測序技術(shù)路徑：

墨卓細(xì)菌單細(xì)胞RNA測序技術(shù)適配自主研發(fā)的MobiNova?-100高通量單細(xì)胞建庫系統(tǒng)，基于半隨機(jī)引物原理，在對細(xì)胞進(jìn)行固定、通透化、細(xì)胞壁裂解、gDNA去除等步驟后，在細(xì)胞內(nèi)完成mRNA分子的捕獲和第一輪預(yù)索引，隨后對cDNA的3’端添加polyA尾巴，并在液滴內(nèi)完成cDNA二鏈合成和第二輪索引條形碼標(biāo)記，然后通過NGS文庫構(gòu)建和測序即可獲得單個(gè)微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息。其基于半隨機(jī)引物原理可對RNA分子全長進(jìn)行無偏捕獲，此外可以捕獲包含lncRNA、CircleRNA在內(nèi)的非編碼RNA。

圖4. 墨卓微生物單細(xì)胞RNA測序技術(shù)路徑

目前墨卓已經(jīng)完成大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的檢測，并且都取得了良好的檢測結(jié)果，充分驗(yàn)證了技術(shù)路徑的可靠性和穩(wěn)定性。而且，該方法的基因檢出靈敏度高，單細(xì)胞中位基因數(shù)可達(dá)數(shù)百，高于文獻(xiàn)報(bào)道的水平。

用大腸桿菌和枯草芽孢桿菌兩種物種進(jìn)行的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，物種之間可以得到良好的分群結(jié)果，證明了方法學(xué)的有效性。

圖6. 雙物種細(xì)胞分群圖

基于墨卓MobiNova?-100自動(dòng)化儀器平臺(tái)的微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的推出，能夠有效輔助科研工作者進(jìn)行微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組層面的研究，為開展單細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組相關(guān)檢測應(yīng)用提供更多助力。

小墨會(huì)繼續(xù)密切跟進(jìn)研發(fā)部動(dòng)向，為大家匯報(bào)更多墨卓微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的最新進(jìn)展，敬請期待哦~~

[1] Christina Homberger and others, Ushering in a new era of single-cell transcriptomics in bacteria. microLife, Volume 3(2022).

[2] Anna Kuchina et al. , Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding. Science371,eaba5257(2021).

[3] Rosenberg, A.B., Roco, C.M., Muscat, R.A., Kuchina, A., Seelig, G., et al. ,  Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science, 360:176-182 (2018).

[4] Ma, Peijun et al. , Bacterial droplet-based single-cell RNA-seq reveals antibiotic-associated heterogeneous cellular states. Cell, Volume 186, Issue 4, 877 - 891.e14 (2023).

[5]. Wenshan Zheng, Shijie Zhao，High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome. Science. 2022 Jun 3; 376(6597)