1. fastq數(shù)據(jù)不可直接合并，墨卓數(shù)據(jù)與10x數(shù)據(jù)的reads結(jié)構(gòu)并不一致，barcode白名單也不相同；

可以被分為兩種情況：

1. 使用--intron excluede參數(shù)時，一條read只有比對到一個基因的外顯子區(qū)域（read有超過50%的長度比對到了外顯子區(qū)域），才會進入計數(shù)，如果比對到內(nèi)含子區(qū)域或基因間區(qū)，則不進入計數(shù)；

針對不同的服務器配置及參數(shù)設置，100G數(shù)據(jù)運行時長并不完全相同。以Hygon C86 7285H 32-core Processor (2.5GHz)處理器為例:

1. 針對10G測序量的樣本，增加線程數(shù)并不能顯著降低分析時間，但會大大增加內(nèi)存的使用量，因此10GB左右的文庫推薦2-8線程；

2. 針對100G測序量的樣本，當線程在24以下時，并不會顯著增加內(nèi)存的使用量，但可以顯著減少分析時間；當線程設置在24以上時，內(nèi)存使用量開始明顯增加，因此100GB左右的文庫推薦16-24線程；

3. 運行的時間和內(nèi)存消耗與文庫本身大小及設置的線程數(shù)有關(guān)，當文庫大小達300GB時，我們建議分析時的內(nèi)存不少于64GB。

1. 過去試劑版本的墨卓單細胞3'轉(zhuǎn)錄組試劑盒制備的文庫，都可以使用MobiVision-v3.2進行分析。

1. 新增命令integrate，擴展了命令集。

2. 加入了新的cutadapt序列剪切步驟，并改進了過濾方法以確保更干凈的polyA切除。

3. 結(jié)果文件中的bam文件內(nèi)容調(diào)整，增加unmapped reads信息和新的tag，改進了mapping info及seq saturation計算。

4. 更新了h5ad文件，改為包含完整矩陣信息。

5. 增加了cell_metrics文件及total genes detected信息，并寫出于summary.csv文件中。

6. 改進了HTML報告的物種信息讀取及mapping information參數(shù)調(diào)整，使其更接近cellranger的設置。

測序飽和度反映了全部測序片段整體的復雜性和測序深度，可通過計算含有有效條形碼和UMI、且能對比至基因組唯一區(qū)域的測序片段的冗余度來獲得。Sequencing Saturation = 1 - non-duplicated_unique_mapped_reads / total_unique_mapped_reads。對于通過mobivision quantify獲得的bam文件而言, MAPQ=255代表能比對至基因組唯一比區(qū)域的測序片段。所以，total_unique_mapped_reads可通過計算MAPQ=255的測序片段中，UMI和Barcode通過糾正的測序片段數(shù)獲得; non-duplicated_unique_mapped_reads可通過計算MAPQ=255的測序片段中，UMI和Barcode不重復的測序片段數(shù)獲得; 代碼如下：

mobivision mkindex命令可用于構(gòu)建reference參考基因組，且指定不同的-m參數(shù)，使用不同來源的參考基因組，均會導致構(gòu)建的reference參考基因組大小并不一致，-m指定值越大，構(gòu)建的參考基因組也越大，且分析速度也會更快。-m默認值為16，若使用默認參數(shù)構(gòu)建人的reference，其參考基因組文件夾大小約為19G，構(gòu)建reference代碼如下：

mobivision quantify目前提供兩種細胞過濾的算法，分別是CR2.2和EmptyDrops （Lun等人于2019年發(fā)表在Genome biology中的算法）。如果用戶需要指定細胞數(shù)目，也可通過--cellnumber INT 來選擇含有UMI數(shù)目排列前INT個的細胞標簽作為有效細胞。

CR2.2算法（見上圖左Panel）：首先將barcode按UMI數(shù)從大到小排序，設N為期望細胞數(shù)，該值默認為3000， m 為期望細胞數(shù)的99分位barcode所對應的 UMI 數(shù)。所有 UMI 值超過 m/10 的barcode都被稱識別為細胞。（例如，當N=3000時，99分位的barcode為第30個barcode，其UMI值記為m，當m=20000時，m/10=2000，那么所有UMI值超過2000的barcode會被識別為細胞，圖示細胞數(shù)為9000）。

EmptyDrops算法（見上圖右Panel）： 參考Lun等人于2019年發(fā)表在Genome biology中的算法(EmptyDrops: distinguishing cells from empty droplets in droplet-based single-cell RNA sequencing data)。該算法是在 CR 2.2 的基礎(chǔ)上進一步識別低RNA含量的細胞，步驟如下：
1. 初步細胞鑒定：與 CR 2.2 一致，使用基于每個barcode的總UMI數(shù)量的閾值來確定高RNA含量的細胞。
- 根據(jù)墨卓單細胞3'/5RNA的細胞捕獲率，預估細胞數(shù)量N
- 根據(jù)每個barcode的UMI數(shù)量降序排列，計算前N個barcode的UI數(shù)量的99分位數(shù)，記為m。
- 如果barcode的UMI總數(shù)超過m的10%，則該barcode被視為含有細胞。

2. 細胞鑒定的細化：
- 選擇具有低UMI計數(shù)的barcode，即第一步未被鑒定為細胞的barcodes。
- 針對這些barcodes的RNA圖譜，基于采用基于基因的多項式分布，創(chuàng)建背景模型，并通過Simple Good-Turing平滑技術(shù)為未觀察到的基因提供非零的模型估計。
- 將每個未在第一步鑒定中被識別為細胞的barcode的RNA圖譜與背景模型進行比較，那些與背景模型明顯不符的barcode被識別為細胞。

V(D)J分析的主要目的是從原始測序數(shù)據(jù)中提取B細胞或T細胞的V(D)J基因序列與克隆型。這個過程通?？梢赃m應不同的測序平臺和數(shù)據(jù)格式。因此，V(D)J分析流程支持多個測序平臺的FASTQ文件。

V(D)J分析流程通常可以支持單端的reads，包括只有一端reads包含有V(D)J基因信息的情況。不過，這取決于所使用的V(D)J分析軟件和具體的實驗設計。

對于單端的reads，V(D)J分析軟件通常會對reads進行一些額外的預處理和過濾，以提高V(D)J重排和克隆型識別的準確性。MobiVision可以處理單端或雙端的FASTQ文件，指定V(D)J基因在reads的哪個位置上，并且可以識別測序的reads來自哪些Barcodes，并確定V(D)J基因的重鏈與輕鏈，從而進行有效的V(D)J分析。

對于特別不常見的物種，構(gòu)建一個參考基因組序列文件可能是一個具有挑戰(zhàn)性的任務，因為缺乏可用的參考基因組或基因組注釋數(shù)據(jù)。以下是一些可能有用的方法：

1. 基于已知的近緣物種: 可以基于已知的近緣物種的基因組序列，利用基因組序列比對和組裝技術(shù)來構(gòu)建目標物種的參考基因組序列。這種方法需要有足夠相似的基因組序列和足夠的比對深度。
2. RNA-Seq數(shù)據(jù)拼接: 如果目標物種的RNA-Seq數(shù)據(jù)可用，可以利用RNA-Seq reads拼接出轉(zhuǎn)錄組序列，再利用轉(zhuǎn)錄組序列和相關(guān)的比對工具如BLAST和STAR等進行基因組組裝和注釋。這種方法適用于不需要完整的基因組序列的情況下。
3. 亞基因組注釋: 如果沒有可用的基因組數(shù)據(jù)，可以考慮使用亞基因組注釋的方法。即先利用相關(guān)的比對工具如BLAST和HMMER等將已知物種的基因組注釋信息映射到目標物種的基因組上，并據(jù)此推斷目標物種的基因組組成和結(jié)構(gòu)。
4. 三代測序輔助裝配: 可以考慮使用更快速和更精確的三代測序輔助裝配技術(shù)，如Oxford Nanopore和PacBio SMRT等單分子測序技術(shù)。這些技術(shù)可以產(chǎn)生長讀長的測序數(shù)據(jù)，有助于更好的基因組組裝和注釋。

在進行原始FASTQ文件的分析之前，通常需要對文件進行命名。雖然不同的實驗室和分析流程可能有不同的命名規(guī)則，但通常應該滿足以下一些基本要求：

1. 文件名應該能夠清晰地反映樣本來源，包括樣本編號、組織來源、處理方式等信息。這些信息可以用下劃線或短橫線等字符分隔，例如:
   Sample1_Blood_RNAseq_R1.fastq(.gz)與Sample1_Blood_RNAseq_R2.fastq(.gz)。
2. 文件名應該包含一些關(guān)鍵的實驗信息，例如測序類型與測序平臺等信息。這些信息可以用下劃線或短橫線等字符分隔，例如：Sample1_Blood_RNAseq_Illumina_PE.fastq(.gz)。
3. 文件名應該能夠唯一標識每個FASTQ文件，避免重復命名或覆蓋已有數(shù)據(jù)?？梢允褂锚毺氐奈募驇в袝r間戳的命名方式，例如：Sample1_Blood_RNAseq_Illumina_PE_20220331.fastq(.gz)。

單細胞VDJ測序數(shù)據(jù)量的合適大小取決于多種因素，包括樣本復雜度、測序深度、實驗設計等。

一般來說，單細胞V(D)J測序的目的是獲得盡可能完整的克隆型信息，因此需要足夠的測序深度來支持高質(zhì)量的重排和克隆型識別。根據(jù)經(jīng)驗，每個單細胞至少需要測序到4000條reads，以保證高質(zhì)量的VDJ分析結(jié)果。

Fraction Reads in Cells是單細胞測序數(shù)據(jù)分析中的一個關(guān)鍵指標，用于評估測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和單細胞捕獲的效率。它表示在所有測序數(shù)據(jù)中，能夠被分配到單個細胞的reads所占的比例。通常來說，F(xiàn)raction Reads in Cells越高，代表單細胞測序的效果越好，樣本中的單個細胞被捕獲的概率越高。

當Fraction Reads in Cells比例比較低時，可能意味著以下一些情況：

1. 單細胞捕獲效率較低：可能是由于實驗操作或測序技術(shù)等因素導致單細胞捕獲效率較低，需要進一步優(yōu)化實驗條件和測序參數(shù)。
2. 樣本質(zhì)量不佳：可能是由于樣本的RNA降解與細胞質(zhì)破裂等因素導致的單細胞的RNA質(zhì)量不佳，進而影響單細胞測序的效果。
3. 數(shù)據(jù)質(zhì)量不佳：可能是由于低質(zhì)量的reads、低覆蓋度等因素導致無法將reads分配到單個細胞中，這需要進行更嚴格的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和過濾。

值得注意的是，F(xiàn)raction Reads in Cells的理想值是依賴于實驗設計和測序技術(shù)等因素，并不存在一個固定的閾值。在進行單細胞測序數(shù)據(jù)分析時，需要結(jié)合其他指標和分析結(jié)果來綜合評估數(shù)據(jù)質(zhì)量和單細胞捕獲效率。

Paired Clonotype Diversity是單細胞VDJ測序數(shù)據(jù)中用來評估克隆型多樣性的一個指標。它基于同一細胞中的配對的重鏈和輕鏈VDJ重排信息，計算出同一細胞中的克隆型數(shù)量，并對不同細胞的克隆型進行聚類，得到每個聚類中包含的不同克隆型數(shù)量。Paired Clonotype Diversity指標即為不同聚類中克隆型數(shù)量的平均值，通常用來描述單個細胞內(nèi)的克隆型多樣性。

Paired Clonotype Diversity計算的具體過程如下：

1. 對每個細胞中的重鏈和輕鏈VDJ序列進行拼接，得到一個全長的VDJ序列。。
2. 利用VDJ分析軟件對全長VDJ序列進行克隆型分析，得到同一細胞中的克隆型信息。
3. 對同一細胞中的克隆型進行聚類分析，得到不同聚類中包含的克隆型數(shù)量。。
4. 計算所有克隆型的細胞數(shù)的逆辛普森指數(shù)，得到PairedClonotype Diversity指標。

MobiVisoion vdj的命名無需固定一種方式命名。從上述的命名規(guī)則中，我們可以看到其ReadType有四種命名形式，Suffix也有4種命名形式，目前MobiVision可以支持16種命名形式。用戶在二代測序結(jié)束下機后獲取的的fastq文件，只要命名合理，一定程度可以直接進行MobiVision vdj分析，無需對樣本名改名。