隨著單細(xì)胞測序（single-cell sequencing）技術(shù)逐漸應(yīng)用于科研，臨床和制藥的研究中，每個月平均發(fā)表的相關(guān)文章高達(dá)100多篇，那么在單細(xì)胞測序應(yīng)用最多的腫瘤領(lǐng)域，各位專家都是怎么用這個技術(shù)在相關(guān)領(lǐng)域深入探究的呢？我們選取了部分文章，來和大家一起了解一下。

第一篇 解析腫瘤藥物毒副作用機(jī)制

文章標(biāo)題：Intermittent PI3Kδ inhibition sustains anti-tumour immunity and curbs irAEs
發(fā)表期刊：Nature
DOI：10.1038/s41586-022-04685-2

這項(xiàng)研究的主要目的是了解PI3Kδ抑制劑的免疫系統(tǒng)相關(guān)毒副作用的深層機(jī)制。

為了分析PI3Kδ抑制劑對腫瘤微環(huán)境的影響，作者首先收集PI3Kδ抑制劑實(shí)體瘤臨床試驗(yàn)中的患者樣本，進(jìn)行了全腫瘤RNA測序、免疫組化及腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞的RNA測序，發(fā)現(xiàn)PI3Kδ抑制劑可以改變腫瘤微環(huán)境。

接下來，作者通過小鼠實(shí)體瘤模型，進(jìn)一步分析PI3Kδ抑制劑副作用的機(jī)制。作者檢測了小鼠不同器官中Treg的水平，發(fā)現(xiàn)脾臟和腸道中Treg水平均明顯下降。

由于患者中的藥物毒副作用在消化道中表現(xiàn)最為嚴(yán)重，因此作者推測腸道中的Treg可能對PI3Kδ抑制劑最敏感。為檢驗(yàn)這一假設(shè)，作者對患者的腫瘤浸潤T細(xì)胞和小鼠模型的消化道Treg細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)腸道中特定Treg亞群對PI3Kδ抑制劑高度敏感。PI3Kδ抑制劑用藥后，由于失去了Treg的調(diào)控，機(jī)體引起腸炎。

為了進(jìn)一步確定PI3Kδ抑制劑與腸炎的關(guān)系，作者建立了小鼠模型，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，給藥組小鼠腸炎更為嚴(yán)重。

最后，作者探索了如何通過調(diào)整給藥頻次來降低毒副作用。作者測試了持續(xù)給藥和間歇給藥兩種方式，發(fā)現(xiàn)間歇給藥可以在一定程度上降低毒副作用，為臨床用藥提供了可能的改進(jìn)方法。

這篇文章用單細(xì)胞測序結(jié)合了bulk RNA seq、免疫組化、動物模型等多種方法，為分析PI3Kδ抑制劑的毒副作用機(jī)制提供了多個層面的證據(jù)。同時，在單細(xì)胞測序方面，作者不僅進(jìn)行了臨床樣本的單細(xì)胞測序，也對小鼠模型樣本進(jìn)行單細(xì)胞測序分析，使得研究能夠兼顧臨床證據(jù)和深入的機(jī)制分析。最后，作者還探索并驗(yàn)證了解決毒副作用問題的可能方法，做到了研究“從臨床中來，到臨床中去”，進(jìn)一步提升了研究的臨床價值。

第二篇 分析腫瘤免疫微環(huán)境

文章標(biāo)題：Extricating human tumour immune alterations from tissue inflammation
發(fā)表期刊：Nature
DOI：10.1038/s41586-022-04718-w

這項(xiàng)研究探討的的是癌細(xì)胞“策反”T細(xì)胞，保護(hù)實(shí)體瘤免受免疫攻擊。

作者收集了非惡性的口腔炎癥組織，以及頭頸鱗癌患者的腫瘤組織和外周血樣本，對其中的T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞進(jìn)行了流式分析和高通量單細(xì)胞測序。
這么一來，作者發(fā)現(xiàn)，雖然腫瘤組織中的大多數(shù)免疫細(xì)胞在非惡性的炎癥組織中也都存在，但一種特殊的Treg細(xì)胞，是腫瘤組織所獨(dú)有的。
這種Treg細(xì)胞具有比一般Treg細(xì)胞更強(qiáng)的免疫抑制能力，可以保護(hù)腫瘤組織中的癌細(xì)胞，讓癌細(xì)胞免遭其它免疫細(xì)胞的攻擊。
相比其它Treg細(xì)胞，這種Treg細(xì)胞的特征是會表達(dá)同時表達(dá)ICOS受體和IL1R1受體——一般的Treg細(xì)胞基本不會同時表達(dá)這兩種受體，因此可以用這兩種受體作為標(biāo)志物，篩選出這種特殊的Treg細(xì)胞。
最后，作者還通過單細(xì)胞公共數(shù)據(jù)集，確定這種Treg細(xì)胞不僅僅在頭頸鱗癌中有，在其它實(shí)體瘤中也有存在——這也許會成為未來實(shí)體瘤治療的突破點(diǎn)。

這篇文章的思路很巧妙，研究的是惡性腫瘤中浸潤的免疫細(xì)胞，而其對照用的是非惡性的炎癥組織——很多其它的腫瘤單細(xì)胞測序研究往往會用癌旁或者正常組織作為對照，這篇文章的對照選擇無疑為我們拓展了新的思路，為從一般炎癥相關(guān)模式中提取疾病特異性變化提供了可參考的優(yōu)秀實(shí)例。

同時，作者也采用了多種研究手段，除單細(xì)胞測序外，還有流式分析、體外免疫刺激和免疫抑制實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子分析、人源化小鼠模型等方法，這讓文章?lián)碛辛烁鱾€不同層面和角度的證據(jù)，豐富全面。而且，文章最后還把重點(diǎn)發(fā)現(xiàn)拓展到了其它實(shí)體瘤中，進(jìn)一步提升了其發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)意義。

第三篇 理解癌癥發(fā)生機(jī)制

文章標(biāo)題：Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer
發(fā)表期刊：Nature Genetics
DOI：10.1038/s41588-022-01088-x

這項(xiàng)研究關(guān)注從健康結(jié)腸到浸潤性結(jié)直腸癌過程中的癌癥發(fā)生機(jī)制。因此，作者對健康結(jié)腸、腺瘤性息肉和結(jié)直腸癌樣本分別進(jìn)行了snRNA-seq（單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序）和scATAC-seq（單細(xì)胞ATAC測序），繪制了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的基因表達(dá)調(diào)控和轉(zhuǎn)錄組變化。

首先，作者對不同類型樣本中的細(xì)胞類型進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在腸息肉和結(jié)直腸癌中均有富集，但僅結(jié)直腸癌樣本中存在耗竭T細(xì)胞富集。

同時，腸息肉和結(jié)直腸癌中還存在著非常不同的成纖維細(xì)胞亞型，可能在癌前病變的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，腸息肉和結(jié)直腸癌樣本中的上皮細(xì)胞里富含干細(xì)胞樣上皮細(xì)胞，這是健康腸道樣本里所沒有的，作者認(rèn)為這些干細(xì)胞樣上皮細(xì)胞可能代表著組織中的“癌癥”干細(xì)胞。隨著疾病惡性程度的加深，樣本中干細(xì)胞的比例也逐漸增大。

隨后，作者將腸息肉和結(jié)直腸癌樣本中的干細(xì)胞樣細(xì)胞與正常干細(xì)胞的基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞樣細(xì)胞和正常干細(xì)胞間的差異隨著細(xì)胞惡性程度的增加而增加。同時還發(fā)現(xiàn)了一系列表達(dá)隨細(xì)胞惡性程度加深而變化的基因，如ASCL2, HNF4A, GPX2等。

最后，作者結(jié)合TCGA中的正常樣本和結(jié)直腸癌樣本甲基化數(shù)據(jù)，對單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了更為深入的挖掘，揭示了具有早期染色質(zhì)可及性變化的結(jié)直腸癌甲基化位點(diǎn)。

這是一篇以單細(xì)胞測序及其分析為主的文章，不涉及任何濕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但這并不影響這篇文章的內(nèi)容豐富程度——它利用單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)，輔以大量深入的生信分析，從轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳調(diào)控兩個層面對數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入挖掘，對細(xì)胞亞群、功能機(jī)制，以及癌前病變的進(jìn)展過程，都提出了很有意義的洞見。同時，和TCGA甲基化測序數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，進(jìn)一步拓展了文章的視角和深度。

第四篇 挖掘腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞特征

文章標(biāo)題：An activation to memory differentiation trajectory of tumor-infiltrating lymphocytes informs metastatic melanoma outcomes
發(fā)表期刊：Cancer cell
DOI：10.1016/j.ccell.2022.04.005

這項(xiàng)研究關(guān)注的是腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL），通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合bulk RNA seq，對TIL進(jìn)行了系統(tǒng)性的分析，總結(jié)了持久存在的駐留記憶TIL細(xì)胞的特征，并發(fā)現(xiàn)了和黑色素瘤預(yù)后相關(guān)的signature。

作者首先利用bulk RNA seq公共數(shù)據(jù)集，分析了多種器官病毒感染后的T細(xì)胞亞群，建立了對T細(xì)胞在免疫反應(yīng)中“基準(zhǔn)”狀態(tài)的認(rèn)知，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可對比的基線。

隨后，作者通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，對13名轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中得到的1500個TIL進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)約2/3的TIL都具有駐留記憶T細(xì)胞的特征，并高表達(dá)免疫檢查點(diǎn)基因、免疫激活標(biāo)志物基因，以及組織駐留相關(guān)的特征性基因。

作者進(jìn)一步對比了對PD-1抗體藥物響應(yīng)和不響應(yīng)的單細(xì)胞黑色素瘤患者樣本，建模發(fā)現(xiàn)：對藥物無響應(yīng)的患者，樣本中激活的TIL較多；而對藥物有響應(yīng)的患者，樣本中存在著高比例的記憶/駐留記憶T細(xì)胞。

激活的TIL亞群和由病毒或疫苗導(dǎo)致的T細(xì)胞狀態(tài)很是相似，同時作者也發(fā)現(xiàn)在其它癌種中也同樣存在，是一個保守的機(jī)制。

而持久存在的駐留記憶T細(xì)胞，其siganature是潛在的黑色素瘤預(yù)后標(biāo)志物，可以再TCGA中很好地對患者進(jìn)行分層，將預(yù)后好和預(yù)后差的患者區(qū)分開來。因此，這個標(biāo)志物也許未來可以應(yīng)用于臨床，對患者進(jìn)行分層管理和治療。

這也是一篇以單細(xì)胞測序分析為主的文章。不過，作者創(chuàng)新性地將系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序相結(jié)合，從多個角度進(jìn)行了全面深入的分析，這是值得參考的思路。同時，作者也通過TCGA數(shù)據(jù)庫，為臨床提供了可能的應(yīng)用點(diǎn)，這也進(jìn)一步提升了文章的檔次。

總結(jié)：

通過以上的幾篇高分文章，我們可以發(fā)現(xiàn)，它們最明顯的共同特征是：用到了多種的方法論。

前兩篇重實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，整合了多種多樣的實(shí)驗(yàn)手段，力求多角度提供支持證據(jù)。

后兩篇重生信分析，不僅進(jìn)行了多種生信分析，同時也通過多組學(xué)的方式，豐富了證據(jù)的視角。此外，這兩篇文章都利用TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了更加深入的挖掘，讓文章更上一層樓——這也是擅長干實(shí)驗(yàn)的老師可以借鑒的方式。

總之，要想文章發(fā)的好，方法多樣不能少。不過，這并不意味著我們必須把已有的實(shí)驗(yàn)方法或生信分析流程全部做個遍，而是可以根據(jù)自己的長項(xiàng)（如更擅長濕實(shí)驗(yàn)中的各種實(shí)驗(yàn)方法，還是更擅長干實(shí)驗(yàn)中的各類生信分析），選擇最能發(fā)揮自身優(yōu)勢的實(shí)驗(yàn)設(shè)計。