2022年AACR年度會議中，Michelle Monje等人關(guān)于CAR-T治療H3K27M突變的彌漫性橋腦膠質(zhì)瘤（Diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG）和彌漫性中線膠質(zhì)瘤（Diffuse midline gliomas，DMG）的研究獲得了廣泛的關(guān)注，而單細(xì)胞測序技術(shù)也在此項(xiàng)研究中發(fā)揮了重要作用。該論文于2022年2月7日在線發(fā)表于國際學(xué)術(shù)期刊《自然》。

CAR-T用于治療H3K27M突變的DIPG/ DMG

CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)是目前廣受關(guān)注的癌癥前沿療法，其原理為：人為給正常T細(xì)胞加入特定癌細(xì)胞表面抗原的受體，使T細(xì)胞能特異的和癌細(xì)胞結(jié)合，從而通過細(xì)胞殺傷作用來殺傷癌細(xì)胞。

CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)一經(jīng)問世，首先在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中發(fā)揮了極大的優(yōu)勢，截至到2022年3月末，已有6款CAR-T 產(chǎn)品中獲 FDA 批準(zhǔn)上市，NMPA也已批準(zhǔn)2款CAR-T產(chǎn)品上市。目前針對實(shí)體瘤的CAR-T治療也在快速開發(fā)中。

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H3K27M型DIPG/DMG是一種極具侵襲性的單發(fā)致命腫瘤，幾乎沒有治療選擇，平均預(yù)期壽命為診斷后10個(gè)月，5年生存率不到1%。

Michelle Monje團(tuán)隊(duì)在此前的研究中發(fā)現(xiàn)，雙唾液神經(jīng)節(jié)苷脂 (Disialogangliosid，GD2）在H3K27M突變的彌漫性中線膠質(zhì)瘤細(xì)胞上高度表達(dá)，因此他們選定GD2作為DIPG/DMG潛在的CAR-T細(xì)胞治療靶點(diǎn)，并在小鼠中進(jìn)行了初步的探索。

在本研究中，研究人員先通過靜脈注射1×10^6 Cells/Kg劑量GD2-CAR T 細(xì)胞的形式對多位DIPG/DMG患者進(jìn)行了篩選，最終選定4名H3K27M突變型DIPG/DMG患者接受GD2-CAR T輸注(3名DIPG患者，1名脊髓DMG患者 )，在腦室內(nèi)給藥。

a．MRI結(jié)果顯示DIPG 3號患者腫瘤明顯減小

b.DIPG 3號患者表現(xiàn)出明顯的生理緩解

臨床結(jié)果顯示，4名患者中有3名在靜脈注射GD2-CAR T細(xì)胞后獲得了影像學(xué)和臨床獲益（一名脊髓DMG患者在CAR T細(xì)胞制備過程中出現(xiàn)了快速的腫瘤進(jìn)展，因而從研究中移除），患者診斷后壽命明顯延長，且患者在神經(jīng)功能方面出現(xiàn)了明顯的恢復(fù)現(xiàn)象。但是，GD2-CAR T細(xì)胞進(jìn)入人體后經(jīng)過了怎樣的歷程？GD2-CAR T細(xì)胞又與癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞發(fā)生了怎樣的相互作用？ 這些還需要更精細(xì)的研究方法來解答。

單細(xì)胞測序解析CAR-T技術(shù)治療過程

為了更加深入地理解GD2-CAR T細(xì)胞輸注后的起效機(jī)制，研究人員利用單細(xì)胞測序技術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步的分析研究。研究者取了4位患者不同治療階段的腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）樣本，以及CAR T細(xì)胞制品中分離得到的CAR陽性、陰性T細(xì)胞，進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序分析。實(shí)驗(yàn)完成25598個(gè)來自CSF，40000個(gè)來自CAR T細(xì)胞制品，共65598個(gè)細(xì)胞的RNA測序。

基于單細(xì)胞RNA測序分析后得到的CSF樣本細(xì)胞圖譜

基于RNA測序數(shù)據(jù)的CSF樣本細(xì)胞圖譜結(jié)果顯示，CSF樣本中除了淋巴細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、罕見星形膠質(zhì)細(xì)胞和B細(xì)胞，還有一群雙重譜系細(xì)胞（右上圖，紅色框框出），暗示患者體內(nèi)可能存在髓樣細(xì)胞吞噬T細(xì)胞的可能性。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析不同的骨髓細(xì)胞亞群

研究者針對給藥后的CSF樣本中髓系細(xì)胞，進(jìn)一步進(jìn)行了更細(xì)致的細(xì)胞圖譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，髓系細(xì)胞可分為7種不同的細(xì)胞群，包括表達(dá)各種功能特征的單核細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，以及增殖的骨髓細(xì)胞。

不同治療時(shí)間段CSF樣本中髓系細(xì)胞比例

分析結(jié)果顯示，在腦內(nèi)室給藥后的炎癥峰值時(shí)間點(diǎn)上，出現(xiàn)了以干擾素應(yīng)答為特征的髓系細(xì)胞，該細(xì)胞群顯示出明顯的免疫激活特征。相比之下，靜脈注射和給藥點(diǎn)晚期，腦脊液髓樣細(xì)胞亞群表達(dá)了顯著的吞噬作用和脂質(zhì)代謝基因程序，這些細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的免疫抑制特征。以上這些結(jié)果都為GD2-CAR T細(xì)胞治療 H3K27M+ 突變型DIPG/DMG 的有效性提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

綜上， 單細(xì)胞測序技術(shù)進(jìn)一步從細(xì)胞層面和基因表達(dá)層面探究了GD2-CAR T 治療H3K27M+ DIPG/DMG的過程，觀察到了不同治療階段、不同給藥途徑、不同患者的異質(zhì)性，對于理解GD2-CAR T發(fā)揮作用的機(jī)理和后續(xù)臨床研究都有指導(dǎo)意義。

單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)用于實(shí)體瘤CAR-T的展望

當(dāng)前利用CAR-T技術(shù)用于治療胃癌、胰腺癌，結(jié)直腸癌，黑色素瘤、肝癌的各項(xiàng)研究正在如火如荼中進(jìn)行。單細(xì)胞測序技術(shù)可用于探究輸注前后CAR-T細(xì)胞的增殖與克隆情況，輸注前后不同階段機(jī)體各細(xì)胞基因表達(dá)的變化，輸注前后機(jī)體各細(xì)胞類型與克隆、增殖和療效間的關(guān)系，體內(nèi)CAR-T細(xì)胞實(shí)際作用情況與機(jī)制等各細(xì)胞治療環(huán)節(jié)。相信未來，單細(xì)胞測序技術(shù)必將在CAR-T等細(xì)胞治療技術(shù)中發(fā)揮更多的作用。

參考文獻(xiàn)

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