單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，是基于單核開展的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究。通過(guò)抽提樣本的細(xì)胞核獲得單核懸液，經(jīng)過(guò)DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察單核的完整度及亮度，從而評(píng)估單核的質(zhì)量，并對(duì)符合質(zhì)量檢測(cè)要求的細(xì)胞核開展轉(zhuǎn)錄組研究的方法。

目前， Sun等^[1] 、Neumann等^[2]，F(xiàn)armer等^[3] 都已經(jīng)利用植物snRNA-seq發(fā)表了相關(guān)高分文章，這些研究成果的發(fā)表有力論證了單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在植物研究中的可行性和可靠性。同時(shí)，也從側(cè)面表明了植物snRNA-seq研究具有一定的優(yōu)勢(shì)。相比于原生質(zhì)體的scRNA-seq，植物snRNA-seq優(yōu)勢(shì)明顯。

高質(zhì)量單核懸液制備耗時(shí)短，效率高

單細(xì)胞懸液制備時(shí)間的長(zhǎng)短影響實(shí)驗(yàn)效率。由于細(xì)胞壁的存在，植物一直都依賴于酶解消化細(xì)胞壁來(lái)制備原生質(zhì)體，從而開展scRNA-seq研究。然而，細(xì)胞壁往往要經(jīng)過(guò)1-2 h的酶解，長(zhǎng)時(shí)間的酶解降低了實(shí)驗(yàn)的效率。

相比之下，單核懸液制備更加簡(jiǎn)單，快速。單核懸液制備包括收獲組織、組織破碎、制備粗核、純化粗核、鏡檢幾個(gè)過(guò)程。物理破碎（研磨法和刀切法）是單核懸液制備的常用方法，幾min內(nèi)即可快速釋放單核，這極大的縮短了單核懸液的制備時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。

此外，細(xì)胞核具有雙層膜結(jié)構(gòu)且核的尺寸較小，因此細(xì)胞核膜堅(jiān)固且不易破碎，從而更容易獲得高質(zhì)量的單核懸液。

樣本要求低，適用于更加廣泛的組織

原生質(zhì)體雖然是植物單細(xì)胞懸液制備的常用方法，但并非所有的組織樣本都能夠成功獲得原生質(zhì)體。想要獲得完整且細(xì)胞活率較高的原生質(zhì)體，一般要求樣本新鮮且幼嫩。這是因?yàn)槊附夥ㄖ苽湓|(zhì)體的過(guò)程中，不新鮮或者不幼嫩的樣本纖維化嚴(yán)重，解離困難，獲得的原生質(zhì)體得率和細(xì)胞活率都相對(duì)較低。然而，在研究過(guò)程中，很難及時(shí)對(duì)獲得的新鮮樣本開展單細(xì)胞研究，獲得的樣本也不總是幼嫩部位，這導(dǎo)致很多植物組織不能開展單細(xì)胞方面的研究。 相比于原生質(zhì)體，單核制備對(duì)樣本的要求相對(duì)較低。基于單細(xì)胞核開展的snRNA-seq研究，其物理破碎制備單核的方案不僅適用于能夠及時(shí)獲得的新鮮樣本，而且對(duì)于冷凍儲(chǔ)存的樣本也十分友好。此外，對(duì)于一些結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜或者纖維化較為嚴(yán)重的組織，如花、果、莖等，也很容易通過(guò)物理破碎的方法制備獲得單核懸液，從而開展snRNA-seq。因此，較低的樣本要求使snRNA-seq能夠應(yīng)用于更廣泛的組織樣本。

樣本捕獲細(xì)胞類型的偏倚性更低

在開展單細(xì)胞研究時(shí)，捕獲細(xì)胞類型的偏倚性會(huì)影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。捕獲細(xì)胞類型的偏倚性是指有些細(xì)胞很容易被捕獲，也有些細(xì)胞難以被捕獲。 酶解法消化細(xì)胞壁制備原生質(zhì)體的過(guò)程中，有些細(xì)胞會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生抵抗性使其細(xì)胞壁很難被酶解消化，同時(shí)有些細(xì)胞亞群難以與酶解液直接接觸，因此這些細(xì)胞都難以獲得原生質(zhì)體，這就導(dǎo)致了scRNA-seq捕獲的細(xì)胞類型具有一定的偏倚性。相比之下，snRNA-seq能夠降低捕獲細(xì)胞類型的偏倚性。物理破碎制備單核的方法簡(jiǎn)單粗暴，對(duì)所有的組織類型“一視同仁”，能夠有效捕獲各種細(xì)胞類型。比如，F(xiàn)armer等^[3]研究中，擬南芥根的snRNA-seq中獲得了比scRNA-seq更多的細(xì)胞亞群。

降低人為因素引入的基因表達(dá)變化

酶解法消化植物細(xì)胞壁時(shí)會(huì)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生脅迫反應(yīng)。對(duì)植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境稱作逆境，又叫脅迫，而酶解消化細(xì)胞壁的過(guò)程就是一種脅迫反應(yīng)。 細(xì)胞處于酶解條件時(shí)，原有的生活條件發(fā)生改變，其往往會(huì)通過(guò)基因的表達(dá)變化做出一系列的應(yīng)激反應(yīng)以適應(yīng)該脅迫條件，此時(shí)的基因表達(dá)變化屬于人為因素引入的轉(zhuǎn)錄偏差。因此酶解法制備原生質(zhì)體可能會(huì)帶來(lái)人為因素引起的基因表達(dá)變化。 然而，單核轉(zhuǎn)錄組獲得的是某一時(shí)刻基因的表達(dá)情況，不會(huì)因?yàn)橥饨鐥l件的改變而導(dǎo)致基因的表達(dá)發(fā)生變化，故snRNA-seq能夠降低人為因素引入的基因表達(dá)改變，獲得的基因表達(dá)水平更加接近于植物原本狀態(tài)的表達(dá)情況。

不受細(xì)胞大小的局限性影響

目前，基于微液滴或微流控原理的技術(shù)是主要的單細(xì)胞研究方法。無(wú)論是基于哪種方法，大尺寸的細(xì)胞都更難被捕獲。這是因?yàn)榇蟪叽绲募?xì)胞容易堵塞孔道，而小尺寸的細(xì)胞更容易通過(guò)孔道，從而捕獲細(xì)胞mRNA。 由于植物細(xì)胞本身的大小差異以及溶液滲透壓的影響，失去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體細(xì)胞容易變大，而這些大尺寸的原生質(zhì)體在上機(jī)時(shí)如果產(chǎn)生堵孔現(xiàn)象，因此通過(guò)原生質(zhì)體開展的scRNA-seq會(huì)降低細(xì)胞的捕獲率。而snRNA-seq受細(xì)胞核尺寸影響更小。相比于單細(xì)胞，單核尺寸更小，并且不易受到溶液滲透壓等因素的影響而改變大小，因此小尺寸的單核更容易通過(guò)孔道，不容易造成堵孔的現(xiàn)象。因此，相比之下，snRNA-seq幾乎不受細(xì)胞尺寸的局限性影響。

數(shù)據(jù)可靠

多項(xiàng)研究表明^[1-3]，單核轉(zhuǎn)錄組不僅能夠獲得有意義的生物學(xué)數(shù)據(jù)，而且與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組獲得的數(shù)據(jù)分析結(jié)果趨于一致，這說(shuō)明了單核轉(zhuǎn)錄組獲得數(shù)據(jù)質(zhì)量的可靠性。

總結(jié)

總之，相比于植物scRNA-seq，植物snRNA-seq具有樣本制備簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)效率高，兼容性強(qiáng)、適用于冷凍樣本，降低人為因素引起的基因表達(dá)改變，更低的細(xì)胞類型偏倚性等優(yōu)勢(shì)。對(duì)于根、葉等容易制備原生質(zhì)體的組織，可以優(yōu)先開展單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究。而對(duì)于花、果、大直徑細(xì)胞、非幼嫩或纖維化嚴(yán)重等難以制備原生質(zhì)體的組織，可以選擇進(jìn)行單核轉(zhuǎn)錄組研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Sun G, Xia M, Li J, et al. The maize single-nucleus transcriptome comprehensively describes signaling networks governing movement and development of grass stomata. Plant Cell. 2022 Apr 26;34(5):1890-1911.
[2] Neumann M, Xu X, Smaczniak C, et al. A 3D gene expression atlas of the floral meristem based on spatial reconstruction of single nucleus RNA sequencing data. Nature Communations. 2022 May 20;13(1):2838.
[3] Farmer A，Thibivilliers S，Ryu K H, et al.Single-nucleus RNA and ATAC sequencing reveals the impact of chromatin accessibility on gene expression inArabidopsis roots at the single-cell level. Mol Plant. 2021 Mar 1;14(3):372-383.